La temporada comienza en la misma escena donde nos dejó la cuarta temporada, Sydney Bristow y Michael Vaughn en el coche camino de sus vacaciones. Tras el accidente, Syd queda inconsciente, cuando se recupera, ha llegado ya la ambulancia y la policía. Se llevan a Vaughn, ella se queda en el coche y ve como un 'policía' va a ponerle una inyección a éste. Syd huye por un campo de maíz mientras la persiguen. Cuando esta a salvo mira hacia el coche y ve como un helicóptero se lleva a Vaughn. Syd vuelve a Los Angeles y Vaughn está desaparecido; un nuevo personaje que parece tener autoridad sobre APO está investigando la fiabilidad de Vaughn, el cual es sospechoso de traicionar a la CIA. Vaughn contacta con Syd y le dice que se lo explicará todo en persona. Cuando llega al punto de encuentro, Syd exige a Vaughn que le de respuestas, y éste empieza por decirle su verdadero nombre, Andre Michau, y que su padre tuvo que cambiar de identidad a toda su familia cuando Vaughn era un bebé, debido a su situación política. Syd se fía, así que se ven con un antiguo contacto del padre de Vaughn, que les promete darles más información si roban un objeto para él. Durante la misión, son descubiertos pero logran escapar apresuradamente, momento en el que llaman a Syd del hospital para darle los resultados de su chequeo posterior al accidente, y le dicen que está embarazada. Cuando se lo dice a Vaughn, a éste al principio parece desagradarle pero de camino al encuentro con el contacto del padre de Vaugnh empiezan a hacer planes, ilusionados, para cuando llegue el bebé. Al llegar a la cita, el supuesto supervisor de la CIA que investiga a Vaughn, es en realidad uno de los malos, pues le ha tendido una emboscada, y tirotea al contacto de Vauhng y él mismo... Tras una larga operación, Vaughn está en situación crítica, pero consciente; Syd y el hablan sobre nombres para el bebé, pero Vaugnh se encuentra cansado, se duerme... Finalmente muere y es enterrado sentidamente, pero parece que no será la última vez que veamos a Andre Michau...

Sydney Bristow se asocia con Renée Rienne (una fugitiva buscada por la CIA) para descubrir al asesino de Michael Vaughn y evitar que ataque de nuevo. Mientras, Jack Bristow recluta a un nuevo agente, Thomas Grace, quien más tarde tendrá algunas dificultades con Sidney, y Weiss deberá decidir si acepta o no un ascenso que le separará de sus compañeros, trasladándole a trabajar a Washington.

Una mujer penetra en unas instalaciones militares en Turquía para robar un dial de algo llamado sustancia 33, un agente biológico desarrollado por los rusos tras la Guerra Fría. En APO, Marshall sugiere que el robo ha sido perpetrado por la organización de Deen, la Cabaña. Jack envía a Sydney, Tom y Marshall a Praga tras un hacker que puede trabajar para Deen, pero al llegar allí descubren que este hacker, Rachel Gibbson, es una agente reclutada por la Cabaña pero que cree trabajar para la CIA, lo que lleva a Sydney a recordar sus viejos tiempos en la SD-6

Mientras Sloane espera la resolución de su sentencia por traición, un misterioso asociado de Gordon Dean le requiere para un favor a cambio de influir en la conducta del jurado.

Sydney y Tom viajan a Marseilles (Francia) cuando descubren que Renée ha robado el crio-contenedor que aloja el cuerpo congelado de su supuesto padre muerto.

Sydney y el equipo de APO consiguen infiltrarse en una fiesta formal de la embajada china en La India para localizar a un traficante de armas.

Sloane decide traicionar a Dean cuando descubre que la condicional de Nadia no prosperará.

Un incidente relacionado con una bomba de microonda lleva a APO a enviar a Rachel a Sao Paolo para investigar esta arma. Pero otra persona llamada 'Bob' ya ha ido tras esa información.

Cuando Kelly Peyton roba a la CIA software relacionado con Michael Vaughn, Sydney es secuestrada por los agentes de Profeta Cinco para hipnotizarla y hacer a su mente regresar a sus tiempos felices con Vaughn.

Tras escapar de Peyton y sus secuaces y descubrir que está en un buque de carga, Sydney se mete a la sala de comunicaciones para enviar un mensaje a APO y permitir que la CIA siga sus pasos.

Tras nueve meses de embarazo y dejar la maternidad, Sydney se sorprende de que su madre, Irina Derevko, manifieste ser una víctima perseguida por Profeta Cinco para recibir información relacionada con 'El horizonte'.

Un mes después, con Sydney de baja por maternidad, se ve forzada a volver al campo de trabajo con la vuelta de su vieja enemiga Anna Espinosa.

Mientras Sydney y el resto de APO intentan descubrir más sobre Profeta Cinco y sus planes, Sloane recibe de parte de Profeta Cinco un bote de suero con la cura para Nadia.

Un chip informático es encontrado en el cuerpo muerto de Renée, llevando a Sydney a contactar con Vaughn.

Sydney debe mantener el secreto y trabajar con Sark para localizar la pista de Ramaldi, perdida en una cárcel italiana, antes de que Sloan, Peyton y el resto de Profeta Cinco lo hagan primero.

Sloane hostiga a Rachel y Marshall para forzarlos a ayudarle a encontrar la pista de Rambaldi donde él la ha perdido.

En medio de las consecuencias de la destrucción de APO, Sydney, Jack y Vaugh deben encontrar una forma de detener a Irina Derevko y Arvin Sloane, empeñados en llevar a cabo el Armagedon final de Rambaldi.